通过LC/MS/MS进行超快速分析

由于同常规系统相比，超快速LC-MS仪器可缩短分析时间十倍以上，这样可改善分析效率，且节能环保。即使在试样基质复杂，使用常规色谱柱难以分离的情况下，超快速系统也可以改善分离性能。因此，该系统日益受到用户欢迎。

常规LC/MS/MS系统可通过简单更换亚2μm色谱柱实现超快速分析，但是真如此么？

如果您已经尝试过在常规LC/MS/MS系统中使用超快速分析色谱柱，您可能遇到过以下问题之一。

· 分离恶化

· 峰形变宽或变形

· 峰面积峰面积重现性差

如果这样，超快速LC/MS/MS系统中的哪些特点可用于解决这些问题？

· 超快速LC/MS/MS的7个要点

以下描述的是常规LC/MS/MS系统关于超快速分析的问题和解决这些问题的要点。

分离恶化问题

在尝试超快速分析时，首先要考虑LC仪器其本身。可以通过减少柱容量（换言之，缩短色谱柱长度）或通过增加流动相流速来缩短分析时间。 尽管如此，常规色谱柱仍会使分离恶化。

减少色谱柱填料粒径和增加理论板数即是一种更好的办法。亚-2μm粒径的填料如今在全球范围内广泛应用，因为当流速增加时等效理论塔板的高度不变，则仍可保持分离性能。

尽管如此，安装在LC仪器上的一根亚-2μm粒径色谱柱，如果初时不是为超快速分析而设计，那么分离则缺乏优化，尽管可以缩短分析时间，但并非按照理论执行。图一为在使用更大内径管路时，样品出峰示例。虽然，为达到超快速分析，系统体积包括系统管路和检测器流通池应保持在较小值。增加使用超快速分析色谱柱可缩短保留时间如表1所示，在系统管路和LC系统其他部分内，会导致分离恶化。

然而，使用亚-2μm粒径色谱柱分离可显著增加系统压力。因为超过了并非为超快速分析而设计的LC系统的压力上限，不能使用亚-2μm粒径色谱柱。

峰形恶化问题

在使用UHPLC（超快速性能LC）进行超快速分析时，进入质谱的峰极窄。然而，使用常规MS/MS仪器不能进行超快速处理，工作周期长，采样频率慢。每个峰采样点数量减少。这是因为这些MS/MS仪器在改变分析状态时耗费时间，如正负离子切换或MRM多反应监测切换，减少了实际用于数据采集的时间。

然而，数据采集点的数量对生成峰形的精确度有很大影响。采集点数量减少，结果形式为非高斯、非重复性峰形。

图2所示为采集点数和色谱峰形之间的关系。显而易见，要获得可重现的、平滑的峰形，每个色谱峰较少要采集10个数据点。当每个色谱峰采集数量仅为4或5个时，则会从一个真正色谱峰形上偏离出来较大一部分。

峰面积重现性恶化问题

上述峰形恶化问题对于峰面积重现性有负面影响。右侧数字显示了数据处理时间（延迟时间和正负离子切换时间）的差异如何影响色谱图与峰面积重现性。表明：时间和正负离子切换时间越长，色谱峰越多，则重现性越差。

虽然较短数据处理时间可能是理想的状态，但是处理时间过短也可能导致开始对目标化合物进行测定时，之前的化合物仍停留在碰撞室中。这种状态则被称作“串扰”。

碰撞室中的惰性气体向碰撞室出口游离时，通过碰撞产生产物离子。然而，因为在常规LC/MS/MS系统的处理中离子速度变慢，数据处理时间的减少量也有限。

超快速LC/MS/MS分析的7个要点

相比于相比于常规LC/MS/MS系统存在的问题，超快速LC/MS/MS系统有以下7个主要特点。

1、超快速梯度

2、超快速进样，包括针清洗和进样时间

3、超快速色谱柱

4、超快速正负离子切换，可以在离子化方式上实现正离子模式与副离子模式间超快速切换。

5、碰撞室技术可加速从碰撞室中驱除产物离子

6、超短延迟时间

7、超快速扫描技术

岛津超快速LC/MS/MS系统由Nexera UHPLC与LCMS-8030组合而成，具有以下特点。

1. 利用较高耐压130MPa的超高压送液泵，配备20μL超低容量混合器，实现超快速、高精度梯度洗脱。

2. 超快速自动进样器进样时间仅为10秒。

3. 超快速色谱柱阵营广泛，例如Shim-pack XR系列色谱柱。

4. 世界超快速15 msec正负离子切换。

5. UFsweeper碰撞室快速去除产物离子。

6. 超快速延迟时间技术使得延迟时间仅为1秒时也能稳定分析。

7. 超快速速扫描--15，000u/sec。

这些特点都有效保证了在传统LC/MS/MS系统基础之上实现超快速分析。

分析水溶性维生素：在不使用离子对试剂的情况下尽可能缩短分析时间

【问题】不使用离子对试剂如何对水溶性维生素进行分析？如何能较大程度的缩短分析时间？

我们对食品中的水溶性维生素进行分析，可以使用离子交换色谱柱或在离子对模式下使用ODS色谱柱。 因为维生素成分相对较少，实现高灵敏度分析便十分重要。同时，我们也需要获得质量数信息，因为这与污染物质相关。

因此，我们研究能否采用LCMS技术进行分析；然而，由于需要易挥发性流动相，我们不能采用当前分析条件。此外，我们知道，如果一种离子对试剂加入到流动相中，将增加使用不同流动相条件的后续分析时的背景。因此，我们需要找到适合LCMS的分析条件，不能采用非挥发性流动相或离子对试剂。此外，因为有大批量试样需要进行分析，我们要缩短当前分析时间。

水溶性维生素是高极性化合物，因此在采用反相色谱法时，显示了极短的保留时间。 尽管使用离子对试剂可延长保留时间，但在进行LCMS分析时，离子对试剂的使用是有限制的；即便如此，也可能较难获取高灵敏度。

作为通过LCMS分析水溶性维生素这一难题的解决方案，我们引入阴阳离子交换多模式ODS色谱柱，Imtakt公司的Scherzo SM- C18柱，和强大的LCMS -8030三重四极杆质谱仪强强联手，可以进行高灵敏度高通量分析。

使用甲酸/甲酸铵缓冲溶液和乙腈梯度组成的典型反相条件，可在10分钟内完成对9种水溶性维生素的同时分析。 这种方法可以进行大量的样品分析，且质谱检测提供了极好的灵敏度和色谱峰识别能力。

使用LCMS-8030分析26种药物成分：分子量数据和结构信息的采集

【问题】检查合成化合物的分子量时，经常要求高通量，分析周期时间的减少是简化程序的一个必要手段。除了结构信息，简单分子量数据也是一个必需的分析目标。

当检查合成化合物的分子量时，一般只有确定分子量是可以接受的。然而，合成化合物中不时出现相同数量的分子量，且这些是否实际上是预期的化学合成物质或只是类似化合物，应予以关注。因此，理想的情况是同时获得化合物的结构数据。然而，由于涉及的样品数量大，通过增加单独的分析运行和寻求新的分析方法以获得结构数据来增加工作负荷是不可取的。有可以同时获得结构数据并确认分子量的LCMS么？

现在对更快的研发以及质量改善方面的呼吁越来越高，化合物确认所需的分子量以及结构数据的需求越加频繁，从而也要求得到LC/MS的母离子峰信息和LC/MS/MS的产物离子质谱图。为了同时获得这些数据，有必要在以获得母离子峰为目的的单一色谱峰洗脱过程和产物离子扫描这两种扫描模式之间进行切换。常规LC/MS/MS系统中，可同时进行正离子和负离子分析，由于切换速度慢，且由于扫描速度减缓，使用多个碰撞能量值可能无法测定产物离子。但是但是，LCMS-8030的超快速极性切换速度（15msec）和超快速扫描速度（15，000u/sec），可以对较窄的色谱峰进行快速质谱解析。

利用LCMS-8030的同步检查扫描Synchronized Survey Scan™ (SSS) 功能

利用自动MS/MS功能，初始MS测定作为触发器，也可获得产物离子扫描谱图（MS/MS谱图）。这样，通过全扫描（Q3扫描）模式测定母离子谱图（MS谱图），然后启动产物离子扫描（MS/MS谱图）测定，可同时获得一个单峰的MS和MS/MS谱图。上述数字显示了利用SSS功能同时进行MS和MS/MS测定的优势。LCMS-8030具有极快的扫描速度（较大15000u/sec）和正/负离子切换速度（15ms），所以从单次的SSS测定中就能获得充分的结果，即使是与正负离子联用时，亦是如此。上述的6个全扫描中，包括使用两种不同碰撞能量条件（高/低能量）的产物离子扫描。

利用SSS功能，逐一对26种成分（药物成分）进行分析。西洛他唑分析结果（正离子模式）如下所示。MSQ3扫描事件中测得质子化分子，并且MS/MS谱图中有两个清晰的产物离子。也通过负离子模式对西洛他唑进行测定，类似正离子模式，在一级质谱中测得去质子化分子，及在MS/MS二级谱图中发现两个产物离子。

26种成分中，24种在正离子模式下进行检测，6种在负离子模式下进行检测。四种需在正负离子双模式下进行检测。有些化合物在正离子模式下灵敏度高，而有一些是在负离子模式下灵敏度高，因此有必要利用正负极性切换进行同时分析。有了超快速极性切换（15msec），LCMS-8030能够同时进行正/负离子测定，从而可靠地检测广泛的化合物，不论化合物电离属性。

一次进样分析特定分子结构的一类化合物：磺胺类药物筛选

[问题] 我们使用三重四极杆质谱仪，特别是母离子扫描和中性缺失扫描，搜索代谢产物，是搜索类似的化合物一种有效的手段。然而，这些方法是冗长的，因为（1）扫描速度慢， （2）扫描范围不是很广，和（3）必须同时改变多个质谱扫描条件重复测定，以获得所需的信息。因为多扫描，正离子测定和负离子测定不能同时进行。试图通过增加扫描速度以减少同时测定数量和设置多重扫描，会导致灵敏度下降和得到不正确的母离子峰信息。降低扫描速度以及重复测定导致质量偏移。一个三重四极杆质谱仪允许在一个单次测定中进行多次母离子扫描或中性丢失扫描，且不会导致质量偏移么？

利用自动MS/MS功能，初始MS测定作为触发器，也可获得产物离子扫描谱图（MS/MS谱图）。这样，通过全扫描（Q3扫描）模式测定母离子谱图（MS谱图），然后启动产物离子扫描（MS/MS谱图）测定，可同时获得一个单峰的MS和MS/MS谱图。上述数字显示了利用SSS功能同时进行MS和MS/MS测定的优势。LCMS-8030具有极快的扫描速度（较大15000u/sec）和正/负离子切换速度（15ms），所以从单次的SSS测定中就能获得充分的结果，即使是与正负离子联用时，亦是如此。上述的6个全扫描中，包括使用两种不同碰撞能量条件（高/低能量）的产物离子扫描

利用LCMS-8030的同步检查扫描

Synchronized Survey Scan™ (SSS) 功能

利用SSS功能，逐一对26种成分（药物成分）进行分析。西洛他唑分析结果（正离子模式）如下所示。MSQ3扫描事件中测得质子化分子，并且MS/MS谱图中有两个清晰的产物离子。也通过负离子模式对西洛他唑进行测定，类似正离子模式，在一级质谱中测得去质子化分子，及在MS/MS二级谱图中发现两个产物离子。

在LCMS-8030中，一些在其它厂家的LC/MS/MS存在的母离子扫描和中性丢失扫描相关的问题都已经解决了。举个例子，可以使用LCMS-8030进行磺胺类药物的母离子扫描和中性丢失扫描。

1.同时轻松地进行三个母离子扫描和三个中性丢失扫描

2.即使在高速扫描时候也不会发生质量歧视。

1.同时轻松地进行三个母离子扫描和三个中性丢失扫描

为了提高肉类和海鲜产品的产量，我们经常使用一种抗菌剂（磺胺类药物）作饲料添加剂和兽药，在肯定列表中也规定它们的限量值。对于没有使用此类药物的肉或海鲜制品，需要进行筛查分析。在扫描速度为6000u/s时进行三个母离子扫描和三个中性丢失扫描（见右表）以进行同时筛查。9种磺胺类药物的混合样品的每个扫描的总离子流色谱图（TIC）见下图。9个化合物都不只在一个扫描事件中检测到，每个化合物都得到了明确的定性信息。例如：4个扫描事件检测到磺胺间甲氧嘧啶。

2.即使在高速扫描时候也不会发生质量歧视。

以多种扫描速度分析一个含有九种磺胺类药物化合物的混合样品，。下面是扫描速度为300， 2000， 6000 和 10000 u/s时的TICs和质谱图。结果显示无论以任何速度扫描，均无明显母离子质量错误。此外，扫描速度为10000 u/s时的质量色谱图峰锐度高于速度为300 u/s时的表示在高速扫描时获取了足够的数据点。

结果显示， 即便在高速扫描情况下，LCMS-8030的母离子扫描或中性丢失扫描分析都是令人满意的，而且，在一次分析中进行多个扫描也不会有质量歧视。

LCMSMS术语迷你导读

母离子扫描与中性丢失扫描

在很多研究领域，一个包含多种杂质的样品分析机场需要对相似结构的化合物进行筛查，如药代动力学。母离子扫描主要用来筛查含有相同子离子的母离子而中性丢失扫描用来筛查解离相同中性碎片的离子。

母离子扫描是经过Q1（质谱的一级）扫描预先选定m/z，在碰撞池（Q2）中进行碰撞诱导解离（CID），然后在Q3（质谱的第二级）检测特定m/z的离子。

（在下图中，只有m/z = m3的化合物能够被检测到。）

相反，中性丢失扫描是是在Q1和Q3间固定一个m/z差值进行的扫描。与母离子扫描相似，对有特定结构的筛选化合物有效。

MRM

MRM表示多反应监测。进行MRM时， 通过Q1(质谱的一级)在离子化后的很多离子中选择一个特定的离子，此离子在碰撞池（Q2碰撞室）中解离（碰撞诱导解离），然后通过Q3在解离产生的离子中检测一个特定的离子(质谱的第二级)。在一次测定中可以设定多个通道。在LCMS-8030中，一次分析较多可以设置512个事件，每个事件可以设置32个通道。

*MRM也被称作SRM（选择反应检测）。

在进行诸如食品中的农药分析这种有高浓度的潜在干扰的分析时，由于有高背景的影响，LCMS在有些时候是不够的。而LCMSMS分析可以利用两级质谱的选择性进行质量分离，从而避免了背景离子的影响。

LCMSMS (MRM)中，分析物峰的离子强度会弱于LCMS (SIM)。尽管如此，LCMSMS的分析灵敏度仍高于LCMS，是因为通过大幅降低噪音水平来提高信噪比 (S/N)。